Jeden z najbardziej popularnych hollywoodzkich aktorów, w 1997 roku zajął 44 miejsce na liście 100 największych gwiazd filmowych wszech czasów brytyjskiego czasopisma "Empire". 

Ukończył Morehouse College w Atlancie, w stanie Georgia. Występował na scenach Broadwayu i off-Broadway, a także w trupie teatralnej Negro Ensemble Company, do której przyłączył się w latach 70. razem z aktorem Morganem Freemanem. Karierę aktorską na srebrnym ekranie Jackson rozpoczął od epizodycznych ról kryminalistów umierających nagłą śmiercią w filmie i telewizji. Pod koniec lat 80. aktor nawiązał współpracę z niezależnym reżyserem Spikiem Lee, od epizodu w filmie "School Daze" (1988), poprzez rolę DJ-a radiowego w "Do the Right Thing" (1989) i człowieka, który pobił Denzela Washingtona w "Mo' Better Blues" (1990). Jego kariera nabrała rozpędu, kiedy otrzymał drugoplanową rolę narkomana w "Jungle Fever" (1991) Spike'a Lee, za którą wyróżniło go jury na festiwalu w Cannes. Po tym sukcesie Jackson otrzymał sporo niewielkich ról w większych produkcjach, między innymi w "White Sands" (1992) i "Czasie patriotów" (1992). W 1993 roku zagrał główne role w dwóch komediach: "Strzelając śmiechem", pełnej gagów parodii "Zabójczej broni", z Emilio Estevezem i Jacksonem w rolach Mela Gibsona i Danny Glovera i "Amos and Andrew", satyrze społecznej wymierzonej przeciwko uprzedzeniom rasowym. Jackson pojawił się też w hicie "Park Jurajski" (1993) Stevena Spielberga i "Prawdziwym romansie" Tony'ego Scotta. Następnie otrzymał jedną z głównych ról w "Pulp Fiction" Quetina Tarantino, gdzie zagrał filozofującego gangstera z fryzurą afro, Julesa Winnfielda. Za tę rolę Jackson otrzymał swoją pierwszą nominację do Oscara dla aktora drugoplanowego. Za rolę w kolejnym filmie Tarantino, "Jackie Brown" (1997) aktor został wyróżniony Srebrnym Niedźwiedziem na festiwalu w Berlinie.

Po uzyskaniu statusu gwiazdy Samuel L. Jackson zaczął występować głównie w hollywoodzkim kinie akcji. W "Szklanej pułapce 3" (1995) pomaga Bruce'owi Willisowi przeżyć w Harlemie, a następnie staje się jego partnerem przeciwko terroryście granym przez Jeremy Ironsa. W "Pocałunku śmierci" (1995) Barbeta Schroedera gra policjanta, który chce dopaść gangstera Nicholasa Cage'a przy pomocy wtyczki (David Caruso), a w "Czasie zabijania" (1996) Joela Schumachera, na podstawie powieści Johna Grishama, bierze prawo w swoje ręce i zabija dwóch mężczyzn, którzy dokonali gwałtu na jego córce. W "Negocjatorze", jako człowiek wrobiony w przestępstwo, Jackson musi przekonać godnego siebie przeciwnika, granego przez Kevina Spaceya, o swojej niewinności. Aktor zagrał też w dwóch filmach reżysera filmów akcji Renny Harlina: w "Długim pocałunku na dobranoc" (1996) jako prywatny detektyw partnerował Geenie Davis w konfrontacji z jej brutalną przeszłością i jej konsekswencjami, natomiast w thrillerze "Piekielna głębia" (1999) walczył w pływającym laboratorium z genetycznie zmodyfikowanymi rekinami. Akcja filmu science fiction "Kula" (1998) Barry'ego Levinsona także dzieje się pod wodą: tajemniczy przedmiot znaleziony w zatopionym statku sprawia, że obsesje grupy naukowców mających go zbadać (Jackson, Sharon Stone, Dustin Hoffman) stają się rzeczywistością. Zapytany o swoją postać w filmie Georga Lucasa "Gwiezdne wojny - Epizod I: Mroczne widmo" (1999), aktor odpowiedział: "Jest czarny". W 2000 r. ukończył pracę nad filmem "Shaft" Johna Singletona, nawiązującym do serii filmów z lat 70. o przygodach detektywa Johna Shafta. Jackson gra też w kolejnej części "Gwiezdnych wojen", "Star Wars: Episode II" (2002). Ostatnio aktor zajął się także produkcją filmową, między innymi "Caveman's Valentine" (2000) i "The 51st State" (2001). 

Prywatnie Samuel L. Jackson jest od 1980 roku mężem LaTanyi Richardson, z którą ma córkę, Zoe.